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常見問題
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  • Jackson凍幹粉抗體溶解保存方法


    儲存:冻干粉原装储存在 2-8℃(不开封原装保存 3-5 年)。

    溶解:加入一定体积 dH2O(参考特定说明书),溶解完全。工作液现用现配。

    保存:

    (短期保存)未稀释的液体,在 2-8℃下稳定約 6 周;

    (長期保存)

    方法一、水化后分装,置于-70°C 或以下冷冻保存,避免重复冻融。

    方法二、添加等体积的甘油(ACS 级或更高),终浓度变爲原来的 50%,以液体袉柦储存于-20℃。


    注意:加入甘油后使蛋白质浓度和稀释的范围都减半(比如:重溶后抗体的浓度是 0.8mg/ml,

    体积 2ml,抗体稀释比例 1:5,000 - 1:100,000 for WB, 加入等体积(2ml)的甘油后, 抗体浓

    度变成 0.4mg/ml,体积 4ml,抗体稀释比例变成 1:2500-1:50000 for WB)。


    水化後保質期:自補水之日起一年。如果測試結果符合預期用途,則可以延長有效期


  • ProSpec 细胞因子和重组蛋白溶解

    我們知道,ProSpec 相當一部分細胞因子和蛋白爲凍幹粉,這使得運輸非常便捷,只要常溫即可。而且,細胞因子和蛋白 凍幹粉非常穩定,在-20-80条件下可保存数年。冻干粉在使用前需进行溶解,然后以液体袉柦加到培养体系。溶解步骤非 常关键,因溶解不好会导致细胞因子或蛋白的失活,这也是很多用户在实际使用中经常遇到的問题。

    那麽,應該如何進行正確的溶解呢? 

    下面我們以 Recombinant Human IL-4 (重組人 IL-4,産品编号:CYT-211)的說明書爲例,對細胞因子或蛋白的溶解方法 進行詳細的闡述。 

    拿到重組人 IL-4 的說明書後,您會發現有一段關于 Reconstitution(重懸)的敘述,這段內容含有溶解相關的所有信息。


    1. Centrifuge the vial prior to opening  

    1 步:開蓋前離心試劑管 

    ProSpec 的細胞因子或蛋白凍幹粉裝盛在塑料管中,爲無菌包裝。凍幹粉在運輸過程中可能會因顛簸而漂散並粘貼于管壁 或管蓋上,所以在打開塑料瓶蓋前,需將凍幹粉通過離心收集到管底,以便用很小體積的液體即可將凍幹粉完全溶解。 

    有很多用户会問一个問题,即应该用多少转速、多长时间離心始s凉埽拍艽锏搅己玫氖占Ч 

    答:有些小型高速離心機(多爲進口品牌)的面板上有一個 Spin 鍵,按了此鍵後,離心機會自動快速上升到其最大速度 (10000rpm 12000rpm),上升到最高點後速度即刻下降,直至停止旋轉,整個過程大約 30s。這個 Spin 鍵足以很好的將細 胞因子或蛋白收集到管底。但有些實驗室沒有這樣的高速離心機,只有最高轉速爲 4000-4500rpm 的離心機。這種情況下,需 3000-3500rpm 離心 5min,也能達到類似的效果。


    2. Reconstitute in water to a concentration of 0.1-1.0 mg/ml. Do notvortex. 

    2 步:用无菌水重懸至 0.1-1.0 mg/ml,不可振蕩。 

    這個步驟即爲溶解步驟,非常重要。 

    1) 一定要用推荐的溶液重懸(或溶解)凍幹粉 

    用于溶解细胞因子或蛋白的溶液千差万别。此例中的重組人 IL-4 需用水溶解,而重組人 IL-2 (産品编号:CYT-209)則需用 20mM Acetic Acid (醋酸)溶解,重組人 TGF-beta1(産品编号:CYT-716)需用 10mMAcetic Acid (醋酸)溶解 (注:即使同一 重組細胞因子或蛋白,不同批次的溶解方法也可能有所不同,因此上面的敘述僅供參考。具體應該如何溶解應以相應批次的官方 說明書爲准)。後續的文章中將對各種溶解液的配制方法進行詳細的闡述,望繼續關注。 

    经常有用户会問,爲什么会有这么多种溶解方法? 

    答:我們知道,蛋白的溶解性与很多因素有关,其中比较重要的是 pH 值和離子強度。ProSpec 的細胞因子或重組蛋白在 出廠前均經嚴格測試,說明上所標明的溶解液是能夠將該細胞因子或重組蛋白完全溶解的液體。如果您所用的溶解液的 pH 值和 離子強度與說明書中所標明的不符,很多時候會造成細胞因子或重組蛋白不能完全溶解或者根本無法溶解,這樣所配得的細胞因 子或重組蛋白必然活性不夠或喪失。 

    有不少用户没注意说明书上的描述,而是根据习惯,直接用 PBS 或培养液(1640 或 DMEM 等)等溶解细胞因子或蛋白的 凍幹粉。這樣做可以嗎?

    答:有時可以,要看具體情況。ProSpec 的大多數細胞因子或蛋白凍幹粉的溶解液不是 PBS,此時千萬不能用 PBS 或培 养液直接来溶解,具体原因在上面已经叙述过。而有部分细胞因子,如重組人 KGF 和重組人 FGF-23 等,說明書上的溶解液即爲 1x PBS,此時用 PBS 溶解完全没問题,那麽用培养液溶解也是可以的,不过最好还是用先用 PBS 溶解,然後再用培養液稀釋。 

    2) 一定要溶解到指定的濃度。 蛋白在一定的濃度範圍內可以保持良好的穩定性,這個範圍就是說明書上所標明的濃度範圍,該例爲 0.1-1.0mg/ml這個濃度範圍對于不同的細胞因子或重組蛋白是不同的。 

    高于或低于该浓度范围会有什么問题呢? 

    答:首先,細胞因子或蛋白會不穩定,即很容易出現活性下降的現象。其次,高于這個濃度範圍,可能會超過該蛋白的 最大溶解濃度,即蛋白無法完全溶解。再者,高于或低于該濃度範圍,蛋白可能會出現聚集(aggregation),最終結果還是部分 蛋白未溶解,導致蛋白活性的減弱。 

    3) 一定不能振蕩(vortex)。 

    這裏所說的振蕩是指用渦旋儀進行快速振蕩。 

    有用户会問,若想保证溶解液与冻干粉充分混匀,以实现细胞因子或重组蛋白的完全溶解,该怎么办呢?

    答:多數細胞因子或重組蛋白的凍幹粉是非常容易溶解的,一般我們用移液槍的槍頭輕吹幾下,即可使細胞因子或重組 蛋白完全溶解。 

    對于不易溶解的細胞因子或蛋白,ProSpec 會在說明書中進行備注。這種情況下,您最好能將要溶解的細胞因子或重組 蛋白放在水平搖床(shaker)上低速摇一秵柋间,促使细胞因子或重组蛋白完全溶解。 


    3. This solution can be stored at 2-8for up to 1week. 

    3 步:该重懸液在 2-8最長可保存 1 周。 

    用说明书上推荐的溶液将细胞因子或重组蛋白重懸到推荐的浓度后,细胞因子或重组蛋白可放置在 2-8,即冰箱的冷藏室。 在這種條件下,細胞因子或重組蛋白的活性最長可保持 1 周。這對一個周期爲 5-7 天的實驗,如 DC(樹突狀細胞)的誘導成熟是 足夠的。在此期間,只要每次從冰箱裏吸取一定量的細胞因子或重組蛋白溶液加入到培養體系內即可。 

    其實,說明書上推薦的濃度對于一般的實驗來講是比較高的。所以用戶通常會將該溶液進一步稀釋後再放在 4保存,待 1 周內用完。如進行稀釋,必須遵照下面第 4 步的方法,即需用含載體蛋白的溶液進行稀釋,否則稀釋後的細胞因子或重組蛋白很 容易會粘附在管壁或瓶壁上,使得溶液中的細胞因子或重組蛋白的濃度下降,細胞因子或重組蛋白的總活性則大爲減弱。


    4. For extended storage, it is recommended to further dilute in abuffer containing a carrier protein (example 0.1%  BSA) and store in workingaliquots at -20to -80

    4 步:如要长期保存,則需用含载体蛋白(0.1% BSA,或 10% FBS,或 5% HSA)的溶液進一步稀釋,然後分裝凍存于-20-80。 

    如果一個實驗周期長于一周,或配制的細胞因子或重組蛋白一次用不完,我們就需對細胞因子或重組蛋白進行長期保存。 方法是:将已重懸的细胞因子或蛋白用含載體蛋白,如 0.1%BSA(牛血清白蛋白)10% FBS(胎牛血清)5% HSA(人血清白蛋白) 的溶液将重懸液进一步稀释,然後分裝凍存于-20-80,即常規冰箱的冷凍室或超低溫冰箱中。 

    经常有人会在细胞因子或重组蛋白冻干粉用推荐的溶液重懸后直接分装冻存于-20至-80,這樣可以嗎? 

    答:不行。我們知道,塑料管壁对多数蛋白均有很好的吸附作用,也就是说溶液中的蛋白很容易粘附在管壁。粘附后, 蛋白是很難與管壁分離的。做過 ELISA 實驗的人都知道,ELISA 的包被抗體(Capture antibody)就是通過這種粘附作用包被到酶 標板上的。 

    載體蛋白,如 1% BSA10% FBS(胎牛血清)5% HSA 等的主要作用是預先封閉塑料管壁上的蛋白結合位點,使細胞因子 或重组蛋白不会粘附于管壁。如果在细胞因子或重组蛋白冻干粉用推荐的溶液重懸后不用含载体蛋白的溶液进一步稀释,而直接 分裝凍存,則溶液中的大部分細胞因子或重組蛋白均會粘附到管壁上,導致溶液中實際溶解的細胞因子或重組蛋白的濃度大爲降 低,最終表現爲細胞因子或重組蛋白活性的下降。 

    因此,在分装冻存前,一定要用含载体蛋白的溶液将重懸液进一步稀释。稀釋後的細胞因子或重組蛋白可爲任意濃度,因大 量的載體蛋白可以保證低濃度細胞因子或重組蛋白仍然維持較高的穩定性。 

    那麽,含載體蛋白的溶液指的是什麽溶液呢?水可以嗎? 

    答:水不可。該溶液通常是指 pH 近中性,有一定緩沖能力的緩沖液,如 PBS,培養液(RPMI1640, DMEM )等。 

    还有一个经常被問及的問题,即在做无血清培养或动物的体内实验时,细胞因子中不能含有 BSA,FBS 或 HSA 等动物或 人的蛋白,要想長期保存細胞因子或重組蛋白該怎麽辦呢? 

    答:一種方法是訂購 ProSpec 的小包装细胞因子或重组蛋白,每磫柟用一只,用后即废弃。


    5. 后续稀释液的配方:即原産品的溶液的配方。 

    总之,爲保证细胞因子或重组蛋白冻干份在重懸后仍能保持良好的生物活性,必须按照说明书中 Reconstitution 的方法 嚴格操作。 

    蛋白有价,实验无价,愿大家珍惜每磫柕验机会,严谨认真,每次均能得到预期的实验结果!


  • 如何確定細胞因子的種屬交叉活性?

    1) 除少數例外,大多數人類細胞因子對小鼠細胞均有活性。

    2) 許多小鼠細胞因子也可作用于人類細胞,但比活性可能低 于對應的人類細胞因子。 

    3) IL-7 等爲數不多的人類細胞因子作用于小鼠細胞時比對應的小鼠細胞因子活性更強。

    4) 幹擾素, GM-CSF, IL-3 IL-4 等細胞因子種屬特異,對非同源細胞幾乎沒有活性。

    5) 相反,成纖維細胞生長因子(FGFs)和神經營養素 (neurotrophins)高度保守,在不同動物種屬細胞上均具有很好的活性。

  • ED50 和 units/mg 之间有何关联?

    ED50 爲半數有效濃度,其定義是可誘導 50%最大反應的細胞因子濃度,這種活性表示法僅適用于劑量反應曲線呈 S 的細胞因子。其實,可以將 ED50 的值接理解爲 1unit。如某種細胞因子或蛋白的 ED50 1ng/ml,那麽 1ng/ml 即可看作是 1unit那麽我們也不難理解,1mg(1x106ng) 該細胞因子或蛋白中應含 1x106/1= 106units. ED50(ng/ml)转化爲 units/mg 的公式如下:

    image.png

  • 爲什么有时在管中看不到细胞因子或蛋白的冻干粉?

    与市场上的许多蛋白産品不同,ProSpec 的産品中均不含载体蛋白或其它添加物(如牛血清白蛋白(BSA),人血清白蛋白 (HSA)和蔗糖等,並且是以最低含鹽量的溶液進行凍幹的,因此凍幹後常常不能形成白色網架結構,而是微量的蛋白在凍幹過程 中沉积在管内,形成很薄或肉眼不可见的透明蛋白层。打开管盖前,我们建议您在小離心机中快速離心 20-30 秒,使附著在管蓋 或管壁上的蛋白聚集于管底。我們的質控步驟保證每管中所含的蛋白量准確無誤,雖然有時您無法看到蛋白粉末,但管中的蛋白 含量仍是非常精確的。

  • ProSpec 细胞因子和蛋白産品的稳定性如何?

    除非在産品说明书中特别注明,ProSpec 相当一部分産品爲冻干粉,它们在室温条件下非常稳定(至少 1 個月)。盡管如 此,我们还是建议您在收到我们的産品后保存于-20℃,以確保蛋白 100%的活性。对于大多数蛋白,重懸后在 4℃僅能短期保存 (1 )。如想長期保存,請先配制成稀釋液(其中必须含有載體蛋白,如 0.1% BSA5%HSA,或 10% FBS),然後分裝凍存于 -20℃-80℃。一定要避免反複凍融,因每次凍融均會引起蛋白的部分失活。

  • Abnova抗體應用類型:

    WB           Western Blot

    WB-Ce   Western Blot (Cell lysate)         细胞裂解液(天然细胞,内源)

    WB-Re   Western Blot (Recombinant protein)   重组蛋白(外源转染质粒到细菌,表达蛋白)

    WB-Ti   Western Blot (Tissue lysate)      组织裂解液(天然组织,内源)

    WB-Tr   Western Blot (Transfected lysate)      转染裂解液(外源转染质粒到细胞,表达蛋白)

    image.png

    實驗類型選擇優先(涵蓋範圍):


    WB > WB-Ti > WB-Ce  


    WB-Re 和 WB-Tr,不推荐。如果客户购买,建议跟客户讲一下,非官网承诺应用类型,厂家不受理投诉。


  • Abnova抗體可以做多少張玻片(IF/IHC)?

    【以1:500稀释比,30ul的小包装抗体爲例】


    1:500稀释 = 500ul 抗体稀释液中加入1ul原始抗体 ==》30ul原始抗体可以配置成爲30ul * 500 = 15ml的稀释后的抗体【工作液】,一张玻片一般用50ul的抗体工作液 = 15 ml / 50ul = 300张

    如果是1:200稀释的话,= 120张


    作业:WB实验,一条膜通常需要1ml的工作液(1:1000稀释的话,需要加入1ul原始抗体溶液),实验磫桚自算?


    PS: 1 ml = 1000 ul


  • ICC,IF,IHC區別

    image.png

    image.pngimage.pngimage.pngimage.png

  • 始s梁-标准曲线不一样?

    · ELISA比色法实验显色,是一个酶催化的实验。在一定范围内,环境温度越高,酶活性越强,相同孵育时间内,温度高的,检测数据高。相同温度,孵育时间长的,检测数据高。

    · 说明书的标曲只是一个参考用途,展示大概的结果袉柦。不能直接使用,否则,始s梁芯兔挥斜匾峁┍曜计妨耍突е苯佑盟得魇榈那呃醇扑懔耍园伞!久看問笛椋笔倍夹枰霰曜记撸攀亲钭既返姆椒ā

    · 标准曲线是否良好? 客户可以绘制相应的拟合曲线(线性,或者曲线袉柦),R2大于0.9以上是可以接受的,0.99那就是非常好,小数点后面9越多越好。


  • 始s梁凶龆嗌俑鲅罚 [举例:KET6013]

    * 始s梁泄娓竦48或者96,通常代表的是反应磫桚或者孔的数量。而不是样品数量。(标准品,对照都会参与到反应或者加入到孔中,因此样品数量肯定会少)


    始s梁凶鲆淮問笛椋枰突ё觯6个标准品(标准品数量,根据各个说明书里面说的来设置,6个浓度点)+ 一个空白孔(标准含量爲0) = 7。通常每个实验都要做复孔(最少2个复孔,也有做3个复孔的。2个复孔意味着1个东西,需要加到2个孔,统计学需求,算平均值等),这么一来被占用的孔就是7*2=14个孔。96-14=82个孔,只有这82个孔可以给客户拿去测试他的样品。如果也算是复孔,那麽就是82/2=41个样品。这是最多可以测试多少样品。

    image.png

    總結:

    【2个复孔】样品数量= [ 96 - (标准品数量+对照组数量)*2] / 2

    【3个复孔】样品数量= [ 96 - (标准品数量+对照组数量)*3] / 3


    #强调#:标准品的数量,阳性对照,阴性对照 的设置,根据说明书来,有些始s梁惺敲挥醒粜远哉盏摹


    以上爲一次性将始s梁杏猛甑难肥俊H绻突б2磫柕验,需要绘制2次标曲。对应的,继续相减。



  • 特殊檢測類型:生物發光法,bio-luminescence

    1. 主要涉及ATP类的始s梁校哪芰緼TP,发光(萤火虫)。

    2. 主要的实验:荧光素酶分析实验。

    image.png

    使用儀器:

    1. 化学发光仪,

    2. 光度计(Luminometer),

    3. 多功能酶标仪(含化学发光,生物发光检测模块)。


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