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組蛋白提取

发布者:艾美捷科技    发布时间:2021-06-08     
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组蛋白有四种类型:H2A、H2B、H3、H4,组蛋白是染色体基本结构蛋白,因富含碱性氨基酸 Arg 和 Lys 而呈碱性,可与酸性的 DNA 紧密结合。因为组蛋白是偏碱性的,因此我们可以使用酸法来提取。


實驗操作步驟:


1、将 3-5×105 个细胞种到 6 孔板中,接着进行自己需要的实验处理,处理结束后开始收蛋白,先用 1×PBS 将细胞洗两次,每次吸尽上清。


2、每孔加入 200ul NETN 裂解液,冰上裂解 15min


High salt NETN buffer


母液

配制 100ML


20mM Tris,PH=8.0

1M

2ml


500mM NACL

5M

10ml


0.5% NP-40

20%

2.5ml


1mM EDTA

0.5M

200ul


H2O


85.3ML


臨用前加蛋白酶抑制劑





3、用细胞刮刮细胞,将细胞收集于 1.5mlEP 管中,1500g,4℃,离心 10min


4、离心结束后可以在管底看到一小团接近透明的沉淀,小心吸尽上清,用 1ML NETN buffer 洗沉淀一次或两次,1500g,4℃,离心 10min


5、吸尽上清,小心吸,沉淀容易被吸走,加入 0.2M HCL 100ul (浓盐酸的浓度为 12M)冰水裂解 30min,(30min 后沉淀变成一个白色的小团块)


6、12000RPM,4℃,15min 离心,此时组蛋白已经溶解在上清中,将上清转移到新的 EP 管中,加入 20ul 的 1M Tris ph=8.0 中和酸性(5 倍体积的 HCL 加 1 倍体积的 1M Tris PH=8.0, 如 100ul 的上清中,可加入 20ul 的 1M Tris。


若中和不充分,则在下一步加入 SDS 的时候溶液会呈现黄色,可适量补加 1M Tris PH=8.0,只到溶液恢复蓝色)。


7、可用考馬斯法測蛋白濃度


8、用 SDS 煮蛋白,100℃,10min.。接下来可进行 Western blot 实验。


9、跑胶时,上样量为 5ug 时比较适宜。可以根据自己的具体实验进行调整。


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