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Western Blot条带灰度分析:Image J和Graphpad运用

发布者:艾美捷科技    发布时间:2021-08-05     
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蛋白表达分析我们可以从蛋白表达与否?表达多少?目的蛋白在哪里表达来分析?而分析蛋白的方法有很多种,其中Western blot(WB,蛋白免疫印迹)就是大家所熟知得方法,WB是研究蛋白表达的一个经典方法。对于一些时间点或者是不同组织蛋白表达量的分析就涉及到量的变化。一些凝胶成像软件带有此分析工具,比如Quantity One,Bandscan,Gel-Pro Analyzer等成像系统专用软件。除了这些软件,还有一个比较简单的综合性质图像处理软件Image J可以很方便的进行灰度分析。而且Image J是开源性质的免费软件,可以在其官网直接下载使用。


对Western Blot条带进行数值化有两种方法——灰度分析光密度分析。灰度是計算機圖像分析儀根據圖像顔色深淺分爲256個級別。灰度值越小物體顔色越深。光密度是指光線通過溶液或某一物質前的入射光強度IO與該光線通過溶液或物質後的透射光強度Ib比值的對數OD=log(IO/Ib);圖像分析中,入射光和透射光強度分別被切片上最亮區域的平均灰度值和待測目標平均灰度值取代,則圖像分析系統的光密度值=log(切片標本最亮區域的平均灰度值(g0)/待測目標的平均灰度值(g))。光密度值越大,物體顔色越深,陽性物質相對含量越大。


對于灰度值來說,切片標本制作時染色時間長短,以及測量時顯微鏡照明光源電壓的大小對其影響很大。而光密度是一個比值。是通過計算一張切片標本最亮區域的平均灰度值與該切片標本中待測目標的平均灰度值的比值,再根據數學公式計算而來的,所以受切片標本染色時間長短及照明光源電壓關系很小。


然而有研究實踐顯示,灰度值與光密度值二者之間存在著線性關系,都可以用來進行WB定量分析。

 同样,Image J软件进行WB条带定量分析时也存在两种方法,此处只列举一种方法,具体步骤如下。

1、下載安裝,並打開Image J软件

2、导入WB条带图片。File→Open→ 弹出对话框→选择文件夹→找到WB条带。

3、把圖片轉化成灰度圖片:Image→Type→8-bit。這時WB圖片將會隨之改變。

1Image-8bit.png

4、消除图片背景的影响。Process→Subtract Background。在弹出的对话框中,填上50基本就可以了,也可以稍高些,并勾上Light background,点击OK即可。此时图片背景会变白一些。

2Subtract-Background.png

5、设置定量参数。Analyze→Set Measurements。在弹出的对话框中勾选Area、Mean gray value、Min & max gray value、Integrated density。

3Set-Measurements.png

6、设置单位。Analyze→Set Scale。在弹出的对话框“Unit of length”后面填上“pixels”,其他的不用改动。

5Set-Scale.png

6Set-Scale1.png

7、把WB圖片轉換成亮帶。Edit → Invert。

8、選擇菜單欄下的一系列不規則圓圈,根據情況選擇一種。然後將圓圈手動拉倒第一條帶,並盡量將條帶都圈起來。

7wb-first-image.png

9、點擊菜單欄Analyze下拉出現的measurement,即可彈出你選定區域的灰度統計值。也可以點擊快捷鍵(英文狀態下的鍵盤m)。

8measurement.png

10、手動移動不規則圓圈至下一條條帶,重複8、9步驟,直至所有條帶都被測量。

11、当测定完所有条带,选结果中的“Edit”的“Select All”,然后复制数据“IntDen”到Excel表即可进行分析。也可以直接在Results对话框中,选择File → Save as,直接导出excel表格。

 

9Save-as.png

9Save-as-excel.png

12、在excel表格中將目的蛋白的灰度值除以內參蛋白的灰度值,進行歸一化處理。

10IntDen-Excel.png


13、下載安裝,並打開Graphpad軟件

14、在对话框左侧栏目“New table & graph”下选择“Column”。然后再右侧选择所要作的图形,以及是否显示误差棒等,具体如下图。

10Graphpad-Column.png

15、在彈出的表格中,填上excel中的比值。

11excel-data.png

16、然后点击菜单栏上Insert → New Graph of Existing Data... 。也可以在工具栏Sheet中的“New”条目下找到。(其实这步可以省略)

10New-Graph.png

17、在弹出的对话框“Create New Graph”中,填写新图名称,选择分析方法,图形,以及误差棒的表示方法,具体如下。(其实这步可以省略)

12New-Graph-1.png

18、此时,可以在工具栏下左侧的状态栏“Graphs”文件夹中找到所建新图“Date 1”。

                           13Graphs-Date1.png    14Graphs-Date2.png

19、此時可以對圖形的外觀進行修改,增加圖片題目以及XY軸名稱。直接在圖上對應位置左鍵點擊修改。

15wb-Gray-analysis.png

20、也可以借助工具欄“Change”中的功能鍵對圖片的柱形圖顔色、寬度、高度、間隔等進行調整。

16Change.png

21、然後點擊工具欄“Export”將新建的柱形圖導出。

17Export.png

22、上面只是單因素的柱狀圖構建方法。如果是雙因素,應該在一開始選擇“Column”時選擇“Grouped”。切記!!

 

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