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Jackson SRM應用熒光標記二抗

发布者:艾美捷科技    发布时间:2020-12-31     
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       艾美捷科技作为Jackson中国区域总代理,将为您提供Jackson的特色优质産品主要包括各种纯化的二抗、标记的二抗(AMCA、 Cy2、FITC、Cy3、TRITC、RRX、TR、Cy5、长臂生物素、辣根酶和碱磷酶标记)、胶体金试剂等。今天主要为您介绍SRM應用熒光標記二抗,看下文介紹:

      如今,科學家們已經研發了多種超分辨率技術,遠遠超出了衍射極限,能夠觀察到分子尺度的細節。SRM技術可以將細胞結構解析爲亞細胞水平,從而獲取有關細胞組分的3D結構的信息,並可以觀察到單分子共定位。下面我們來簡要概述了時下幾種最流行的SRM技術的原理:

       1.受激發射耗竭(STED)顯微鏡

      STED對于有經驗的熒光顯微鏡使用者來說相對簡單,該方法和普通共聚焦顯微鏡(Confocal)的原理相同。普通Confocal使用單光源,而STED使用雙光源。其中一個光源發射能激發熒光團——熒光標簽(研究者們以此來定位和觀察蛋白)的光,另一個光源發出不同波長的光,用于抑制熒光。這束光是環形的,並且與第一束光有所重疊,因此只有環形中間區域的分子會繼續發出熒光。

獲得STED超分辨率圖片並沒有那麽複雜,用戶需要仔細調整參數,才能得到漂亮的結果,否則所得圖片和普通confocal沒有差別。


STED.jpg


      使用傳統和RESCue受激發射減損顯微鏡(STED)得到的細胞核膜上核孔複合體的圖片。

       STED的原理:

      顯微鏡透鏡對光的衍射會導致來自單個點的光出現在較大的區域,這稱爲點擴散函數(PSF)(見圖1),由于PSF的存在,使得常規顯微鏡無法達到超分辨。


PSF.png

       图1:在普通光學顯微鏡中,成像是通過將來自點光源的光線會聚到像平面上的單個點來實現的。超出光衍射的限制,防止了射線的精確會聚,從而導致物體的圖像模糊。顯微鏡的分辨率取決于點擴散函數(PSF)的大小,或對象在某個點的三維強度分布。在STED中,應用環形炸彈耗盡型激光器,其零點與激發激光焦點的最大值重疊。STED激光器引起熒光的“飽和耗盡”,從而“抑制了來自零點附近區域的熒光,導致有效PSF的尺寸減小”。

      而受激发射耗竭(STED)显微镜通过限制样品的荧光区域(PSF)产生超分辨率图像。STED显微镜使用两个重叠的激光,第一个按照常规显微镜激发荧光团(图2A)。第二个激光器称为耗尽激光器(STED激光器),它激发“甜甜圈”形状的激光,其中心的零强度点非常小(?30 nm)(未激发)。除了在甜甜圈的中心处之外,第二激光起到了“關閉”第一激光所产生的外圈荧光,从而将样本激发的荧光分子范围缩小到中心圆点处,这有效地降低了PSF,以产生非常小的单分子荧光聚焦区域,从而获得高分辨率图像(图2D)。


PSF-1.jpg

       图2

      1.单个小于250 nm的蛋白质无法通过标准共聚焦成像解析,从而导致图像模糊

      2.STED耗盡激光器産生了淬滅外圍熒光的“甜甜圈”

      3.飽和耗盡在功能上降低了激勵PSF

      4.隨之可以解析單個蛋白質

       適用于STED的熒光團偶聯抗體:

      爲了獲得超分辨率,染料必須具有STED激光波長的高發射截面,並有效地實現高飽和度。這種強烈的照明確保了所有被STED激光“關閉”的分子都受受激發射的支配。合適的染料應具有低的光漂白性,具有高的量子産率和對比度,並在目標附近具有足夠的標記密度。

      Jackson提供熒光染料標記的二抗,下列染料標記的二抗已被驗證在STED中成功使用:


染料貨號
AlexaFluor®488115-545-003
FITC715-095-150
AlexaFluor®594715-585-151
AlexaFluor®647 

     

        2. 隨機光學重建顯微鏡(STORM)

      最有名的“基于探针”的技术是Betzig等人研发的光激活定位显微技术(photoactivated localization microscopy, PALM)和哈佛大学庄小威实验室发明的随机光学重建显微技术(stochastic optical reconstruction microscopy, STORM)。最初所有的荧光标签都是暗的。然后使用激光脉冲来激活一小部分荧光标签,随后使用另一束光来關閉这些荧光标签。不断重复这个过程,生成一系列部分荧光图,最后重建成整个视野的荧光图。,以产生分辨率优于常规方法收集的图像。


STORM.jpg


      使用超分辨率随机光学重建显微镜(stochastic optical reconstruction microscopy,STORM),科学家首次观察到了神经元轴突的细胞骨架。

      Jackson提供適用于dSTORM應用的標記二抗,簡而言之,較低強度的激發光激發樣品,隨機激活少量染料分子。單個發熒光的染料分子足夠分散,因此可以計算其點擴散函數的中心,從而推斷出染料的確切位置。然後使用第二激光關閉所有分子,並重複該過程。然後,通過重疊每種染料的所有映射點擴展函數,以數學方式生成高分辨率圖像。

       用于單分子定位實驗的熒光團偶聯抗體

 用于单分子定位的最佳染料通常非常亮,并产生足够的光子以可靠地产生紧密的高斯分布。Jackson ImmunoResearch提供了多种广谱范围内的可靠染料,例如AlexaFluor®488,AlexaFluor®647和Cy™5,可用于这些类型的实验。

       建议用于超分辨率显微镜的荧光染料偶联物:


STED激發波長(nm)發射波長(nm)
Alexa Fluor® 488493519
荧光素 / FITC492520
Alexa Fluor® 594591614
Alexa Fluor® 647651667

 

STORM激發波長(nm)發射波長(nm)
Alexa Fluor® 488493519
Alexa Fluor® 647651667
Cy™5650670

      每种SRM技术都有各自的探针选择要求,Jackson ImmunoResearch提供多种已知在SRM应用中表现良好的荧光标记二抗。应该注意的是,SRM领域变化迅速,因此,建议从专业技术文献中寻求信息,以帮助选择合适的荧光团。

      更多相关Jackson ImmmoResecarch品牌的SRM應用熒光標記二抗産品详情,欢迎点击查看:超分辨率顯微鏡分析,熒光抗體該怎麽選?

      作为Jackson ImmmoResecarch在中国的区域代理,艾美捷科技有限公司将为中国客户提供最全面的ackson ImmmoResecarch品牌的SRM應用熒光標記二抗産品以及订制服务,欢迎随时聯系我們。


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